HPV并不是宫颈癌唯一的“元凶”？这种微生物化身“帮凶”，共同促进癌症发生

宫颈黏膜是抵御病原体侵入女性上部生殖道的保护屏障，经常受到入侵病原体和生态失调的挑战。宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，是仅次于乳腺癌的威胁女性健康的第二大「癌症杀手」。我国每年新发宫颈癌患者约 13.2 万人，约占世界宫颈癌新发病例总数的一半，而死于宫颈癌的患者多达 5.3 万人。宫颈癌严重威胁着我国女性的健康。

众所周知，HPV 是促进宫颈癌发生发展的重要病原体。但是研究表明，80%以上的女性在其一生中都会感染HPV，但只有不到2%的女性会患上宫颈癌。除 HPV 外，沙眼衣原体（C. trachomatis）也是宫颈感染的常见病原体。在浸润性宫颈癌和卵巢癌患者中，沙眼衣原体合并 HPV 感染的发生率增加。有研究者认为衣原体感染可能改变患者的免疫力，使其对 HPV 易感，从而易进展为宫颈癌，但合并感染的动力学和潜在机制尚不清楚。

继Hans Clevers团队开发了首个宫颈癌类器官（Organoids）模型后【1】，类器官在宫颈癌中的研究得到了进一步的重视和推动。类器官可以在体外很好地模拟体内器官的三维结构和功能，相比于二维的细胞系和单纯的小鼠模型具有其独特的优势，已被广泛应用于功能组织诱导、疾病模型构建、药物筛选等研究中。

2022 年 2 月 24 日，来自德国的Cindrilla Chumduri团队开发了一种模拟 HPV 和沙眼衣原体共感染的宫颈癌类器官模型，并阐明了HPV和沙眼衣原体（C. trachomatis）共感染诱导的独特转录和翻译后导致宿主细胞重编程的机制，揭示了宫颈癌的发生发展机制。

该成果以 Modelling Chlamydia and HPV co-infection in patient-derived ectocervix organoids reveals distinct cellular reprogramming 为题，近期发表在Nature Communications期刊上【2】。

宫颈癌类器官模型的构建

HPV E6E7 是指人乳头瘤病毒的 E6 和 E7 两个基因，两者都是早期转录基因，常用来检测是否有 HPV 感染，以及感染的严重程度。HPV E6E7 基因阳性，代表感染了 HPV 病毒，病毒 DNA 已经整合到了细胞 DNA 中，同时进行了蛋白质的表达。

为了系统评估 hpv16 E6E7 整合和随后与沙眼梭菌合并感染对宿主调节的影响，研究人员从健康志愿者上分离出宫颈外干细胞，将其嵌入基质胶中培养 3D 类器官，并检测了来自各种 HPV 类型的 E6E7 基因。来自三个供体的子宫颈外器官检测 HPV 的 E6E7 癌基因均为阴性。这些来自健康供体的 HPV E6E7 阴性的类器官被用于研究 HPV 整合对健康宫颈组织的影响。

随后，研究人员用携带 HPV16 E6E7 癌基因的慢病毒转染 hCEcto（human ectocervical，人子宫颈）上皮干细胞，将 E6E7 整合到宿主细胞基因组中。结果发现，HPV16 E6E7 整合到外宫颈类器官中会诱导一种具有子宫颈上皮不典型增生（CIN，被认为是癌前病变）特征的表型。

因此，这种宫颈类器官模型的构建为研究 HPV 和共感染生物学开辟了一条途径。

沙眼衣原体与 HPV 合并感染引起独特的转录反应

为了探究宫颈中沙眼衣原体和 HPV 共感染的影响及其相互作用，研究人员又在上述 HPV 类器官模型的基础上，构建了沙眼衣原体共感染的类器官模型。结果发现，HPV E6E7 的表达干扰了沙眼衣原体的正常发育，而且还发现，沙眼衣原体感染在单一感染和与 HPV E6E7 的联合感染中均诱导增殖信号。

接下来，研究人员进行了转录组分析以确定沙眼衣原体、HPV E6E7 单一感染和合并感染对细胞信号传导的影响。结果发现，hCEcto E6E7 细胞与沙眼衣原体的共感染表现出独特的基因表达变化。引人注目的是，在被 HPV E6E7 上调的基因中，28% 的基因在与沙眼衣原体共感染时恢复到与对照相似的表达水平，或者被强烈下调。

其中，E2F 家族成员是最显著的反向调节转录因子。E2F 靶基因被 HPV E6E7 显著上调，但在沙眼衣原体感染后下调。目前尚不清楚这种沙眼衣原体介导的对 HPV E6E7 诱导的 E2F 靶标的抑制将对宿主细胞和病原体产生什么影响。

为了研究两种病原体对 Rb-E2F1 途径的调节，研究人员用沙眼衣原体感染了 hCEcto 类器官和 hCEcto E6E7 类器官，并进行了 qRT-PCR 和免疫印迹分析。结果显示，在没有 HPV E6E7 表达的情况下，沙眼衣原体显著抑制 E2F1 和肿瘤抑制因子 p53，而共感染导致TP53明显减少，但 E2F1 和 RB1 转录本没有显著减少。

与沙眼衣原体感染相反，HPV E6E7 上调 TP53、E2F1 和 RB1 基因表达。无论是否感染 HPV，沙眼衣原体感染 hCEcto 细胞后，总 Rb、pRb（S807/811）、E2F1 和 p53 蛋白减少。然而，E6E7 表达增加 E2F1 蛋白水平并诱导 p53 几乎完全降解，而对总 Rb、pRb（S807/811）蛋白水平没有显著影响。

因此，上述结果表明，HPV 会诱导 E2F1 激活，而衣原体则对其发挥抑制作用。感染 HPV 后，p53 在转录水平上上调，而在感染衣原体后下调。HPV 和衣原体共同感染导致 p53 蛋白降解。

随后，研究人员通过在未感染、感染沙眼衣原体、表达 E6E7 和共感染的 hCEcto 细胞之间进行 GSEA 分析，评估受差异表达基因（DEG）影响的生物学功能。结果发现，HPV E6E7 和沙眼衣原体均强烈上调肿瘤坏死因子（TNF）通路，促进宿主细胞干性并减少分化。

值得一提的是，参与 DNA 复制的通路、DNA 损伤修复通路包括碱基切除修复（BER）、错配修复（MMR）、核苷酸切除修复（NER）、范可尼贫血（FA）、同源重组（HR）和 p53 信号通路是由两种病原体相反调节：HPV E6E7 表达激活这些途径，而沙眼衣原体抑制它们。

沙眼衣原体感染抑制 DNA 错配修复通路

由于 E2F 转录因子家族（参与细胞增殖和生长停滞的几个基因的重要调节因子）被沙眼衣原体和共感染下调，研究人员进一步分析了 E2F 转录因子家族在衣原体感染细胞中发挥的作用。

RB 样、E2F4、多种外阴 B 类蛋白和二聚化伴侣（DP1）通过形成 DREAM 复合物，可介导基因抑制促进静止。若失去细胞周期检查点基因表达，DREAM 复合物介导的调控将会中断，进而打破细胞周期的平衡，从静止切换到增殖，这在癌症中经常观察到。

该研究分析显示，许多 DREAM 复合靶基因被衣原体下调，在合并感染中可以阻止静止并促进细胞增殖。而且参与 DNA 修复途径的基因属于受衣原体和 HPV 反向调控的 E2F1 靶基因。沙眼衣原体感染导致 HPV 诱导的 MMR（mismatch repair，错配修复）基因的抑制。

总之，衣原体在转录和翻译后水平抑制 MMR，并且它可以进一步抑制 HPV 激活的 MMR。

衣原体和 HPV 调节 MMR 途径的机制

最后，研究人员试图从机制上阐明衣原体和 HPV 是如何调节 MMR 途径的。

根据文献报道，MMR 基因受 E2F 转录因子的调节。Rb-E2F 和 MDM2-p53 通路之间存在广泛的串扰，而且两者在大多数人类肿瘤中都存在缺陷，这强调了这些通路在调节重要细胞决策中的关键作用。

研究人员采用了蛋白酶抑制剂 MG-132 和 Lactacystin 来抑制细胞和衣原体蛋白酶 CPAF32，使用 Nutlin-3a 抑制 MDM2 和 p53 之间相互作用，以检测 p53 稳定对 MMR 基因表达和蛋白水平的影响。结果表明，Nutlin-3a 和 MG-132 处理恢复了沙眼衣原体感染后的 MMR 基因表达，并可以抑制沙眼衣原体诱导的 p53 降解，而 E2F1 的降解在所有处理条件下均降低。

值得注意的是，MMR 蛋白 MLH1 和 MSH6 仅通过 MG-132 抑制蛋白酶体活性得以恢复。该结果表明，衣原体参与不依赖 p53 的蛋白酶体降解以减少 E2F1 和 MMR 蛋白，而 E2F1 和 p53 蛋白的恢复可以挽救 MMR 基因的转录抑制。

为了进一步研究沙眼衣原体如何调节 HPV E6E7 共感染中的 MMR 途径，在有或没有沙眼衣原体感染的情况下，用 Nutlin-3a、MG-132 和 Lactacystin 处理 hCEcto E6E7 干细胞。结果显示，所有处理条件都降低了沙眼衣原体的感染性。以上结果表明，蛋白酶体降解是一种重要机制，可明显调节 E2F 介导的 MMR 基因转录并减少共感染中的 p53、E2F 和 MMR 蛋白。

研究意义

超过 80% 的女性在其一生中会感染 HPV，但只有不到 2% 的女性会患上宫颈癌。而宫颈癌患者常常同时感染人乳头瘤病毒（HPV）和沙眼衣原体，因此科学家推测沙眼衣原体和 HPV 合并感染是驱动恶性组织形成的重要因素，但其背后潜在的机制仍然是未知的。

病毒可以在肿瘤中留下可检测的 DNA 片段，在 90% 以上的宫颈癌中可以检测到病毒的 DNA 片段。但与病毒不同，衣原体很少在癌细胞中留下可检测的元素，因此其诱发癌变的具体机理难以厘清。

在该研究中，研究人员开发了一种模拟 HPV 和沙眼衣原体共感染的宫颈癌类器官模型，并阐明了 HPV 和沙眼衣原体合并感染后，会导致宿主独特的细胞重编程。该研究将衣原体感染与宫颈癌的发展联系起来，进一步揭示了宫颈癌的发生发展机制。

被 HPV 和衣原体感染后，多个基因以不同的方式上调或下调，影响宿主的免疫应答和 DNA 损伤修复。总体而言，两种病原体在干细胞中的合并感染可能会对细胞和基因组稳定性产生不利影响，并促进肿瘤进展。

这项研究还具有两个关键意义：

1）研究人员引入了一种宫颈类器官模型，以研究分层上皮组织屏障与 HPV16 E6E7 和衣原体的个体和共感染动力学的相互作用。该研究中开发和使用的宫颈类器官被证明是出色的体外模型，可用于研究上皮组织与病原体之间的复杂相互作用以及分析发病初期事件的分子后遗症。

2） 研究人员系统地揭示了 HPV16 E6E7 和沙眼衣原体对宿主细胞的影响，展示了多重或连续感染带来的危害以及导致致癌的分子机制，阐明了宫颈癌的发生发展机制。

参考文献：

https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(21)00118-1